| WB實驗中化學發光成像系統的使用 | |
加入日期：2017.04.07 瀏覽次數：1310次
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| WB實驗中化學發光成像系統的使用 一般的WB檢測過程中，都會有膜的封閉、一抗孵育、二抗孵育和底物顯色這四道“加工”工序。最后的底物顯色是最關鍵的一部，也是最有文章可作的一個部分。 WB顯色的方法主要有放射自顯影、底物化學發光ECL、底物熒光ECF和底物DAB呈色四種方法，發表文章通常是用底物化學發光ECL，操作比較簡單，只需要購買現成的化學發光檢測試劑盒即可。試劑盒中一般使用的反應底物A和B分別是魯米諾(又名發光氨) 和過氧化氫，原理如下(二抗用HRP標記)：在HRP的催化作用下，魯米諾與過氧化氫反應生成一種過氧化物，過氧化物不穩定隨即分解，形成一種能發光的電子激發中間體，當后者由激發態返回至基態，就會產生熒光，可用X膠片和成像設備進行檢測。使用傳統的X膠片顯影方法進行WB實驗時，最后需要使用暗室曝光來進行ECL檢測，但是建造暗室浪費空間，在暗室中曝光步驟繁瑣，沖洗X光片時會接觸有毒的化學藥劑。化學發光成像設備能夠對ECL發光直接成像，獲得實驗結果，避免暗室曝光的不便。 是否能夠拍攝到ECL的圖像主要取決于設備是不是帶有制冷的CCD，只有制冷的CCD才夠靈敏地捕捉到膜上發出的光。隨著Cooled-CCD技術的發展，成像系統成本越來越低，因而在現在的實驗室里這些設備越來越普遍。本實驗室目前采用的是化學發光成像系統，具有靈敏度高，成像速度快、成像效果清晰等優點。 該儀器的使用非常簡單： 1）在使用前開機預冷，待儀器溫度降到-20℃才可以進行檢測； 2）將化學發光檢測試劑盒中的A和B按照1:1混合； 3）PVDF膜正面朝上放于暗箱，用移液槍將發光液均勻地涂在膜上，關閉暗箱箱門，進行曝光； 4）曝光可以自動曝光，也可手動曝光，一般先點擊自動曝光，觀察成像效果，若不理想可再手動調節曝光時間； 另外該儀器還具有多張拍攝模式，可將一張膜在不同的曝光時間下連拍6張，使曝光更方便。 內參一般顯影15s（影像條帶粗細深淺一致說明內參已調齊），內參好說明各步實驗操作均無誤，即可進行后續的目的蛋白檢測，目的蛋白結果的好壞就取決于其表達量以及抗體的特異性和效價了。 與X膠片相比，化學發光成像系統具有瞬時影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費、可用軟件半定量分析等優點，因而在現在的實驗室里化學發光成像系統的使用已經逐漸取代傳統的暗室壓片曝光檢測。 |
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